译文 | 保护肾脏的乳酸菌混合物在慢性肾脏疾病中的功效及可能的作用机制

总结

慢性肾病（CKD）是猫科动物种群中等待解决的重要问题。益生菌预防/缓解慢性肾病的功效已在动物模型中得到广泛研究。这项初步研究结合了保护肾脏功能性的乳酸菌混合物（Lm）的宠物食品，作为益生菌宠物零食。CKD（第2期和第3期）的猫显示，在每天服用Lm宠物零食8周后，通过改变肠道微生物群的组成和代谢模式，肾功能和生活质量得到改善。本研究阐明了在CKD的猫中，Lm提供了一种可能的益生菌治疗的新方法。

摘要

基于微生物群的策略，是缓解慢性肾脏病（CKD）的一种新型辅助治疗和预防方法。乳酸菌混合物（Lm）先前被证明在CKD小鼠模型中发挥肾脏保护功能。益生菌在宠物食品中的功效是一个相对较新的研究领域，因此有必要验证其潜在的健康益处。本研究评估了 Lm治疗对猫CKD的疗效，并阐明了宿主-微生物相互作用的潜在机制。慢性肾病猫（2期和3期）每天服用益生菌宠物零食（10克）持续8周。结果表明，在 Lm 给药的 8 周内，所有患有CKD的猫的肌酐降低或维持。同样，肠道来源的尿毒症毒素（GDUT）硫酸吲哚醇酯（IS）在Lm治疗后具有潜在的临床意义（置信区间 = 90%）。猫的生活质量也有所改善。猫肠道微生物组数据、代谢功能通路和肾功能指标分析揭示了调节CKD猫微生物组成的可能机制。Lm给药后微生物在氨基酸代谢中的功能进一步调节有助于下调有害的GDUTs。目前的研究为益生菌宠物食品或CKD宠物的零食提供了潜在的辅助治疗见解。

关键词：慢性肾病；肠道微生物群；益生菌；Lm 宠物零食；猫

1、引言

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）定义为肾脏结构或功能异常，表现超过3个月。肾脏清除率降低会导致尿毒症毒素在体内积聚，从而引起肾脏、心血管系统、免疫系统和肠道受损。在猫科动物中，CKD的平均患病率为~1%-3%，但在老年猫科动物群体（>15岁）中增至80%。猫CKD的常见症状包括体重和肌肉减轻、呕吐、厌食/低食欲（高达92%的猫）、便秘、蛋白尿、非再生性贫血和低钾血症。迄今为止，尚无没有劣势和副作用的CKD的治疗方法。CKD的进展可以通过限制蛋白质摄入、减少尿毒症毒素吸收、透析或肾移植来控制。饮食中的磷含量和钙磷（Ca：P）比是需要考虑的关键因素。理想情况下，膳食Ca：P比值应为1或更高。

硫酸吲哚酚(IS)、对甲酰硫酸酯(PCS)和三甲胺N-氧化物(TMAO)是肠道来源的尿毒症毒素(GDUTs)，是由一些蛋白质水解细菌(如大肠杆菌、艰难梭菌和志贺氏菌)在宿主肠道中分解膳食蛋白质产生的。循环IS和PCS水平升高与肾功能呈负相关，并与肾小球滤过率下降密切相关。因此，基于微生物群的策略可能为CKD提供潜在的辅助治疗和预防方法。

益生菌预防慢性肾病的功效已在动物模型中得到深入研究。益生菌不仅能增强肠道内的稳态，还能减少尿毒症毒素的产生或滞留。嗜酸乳杆菌NT降低了56只肾切除小鼠的尿蛋白排泄、血清尿素氮、IS和PCS，减轻了全身炎症和肾硬化。在顺铂诱导的CKD兰玉猪模型中，益生菌混合物下调了血清中的IS水平，并通过将肠道微生物群的组成向正常对照组转移来减少肾脏中的纤维化和氧化应激。在临床研究中，CKD犬猫在接受益生菌治疗后也显示出肾功能改善。然而，大多数研究缺乏深入的机制研究。

在我们之前的研究中，从传统发酵乳中分离出的乳酸杆菌混合物（Lm、副干酪乳杆菌 MFM 18 和植物乳杆菌 MFM 30-3）在 CKD 小鼠模型和人体临床试验中发挥了肾脏保护作用。还阐明了Lm的可能机制，包括Lm介导的微生物组成、代谢反应和代谢物谱的互连和调节。

用粉末、胶囊或片剂形式的益生菌治疗宠物具有挑战性，因此将益生菌与饲料或宠物零食相结合可能是一种潜在的解决方案。然而，某些因素，如微生物特性（耐热性、耐氧性、耐酸性和胆汁性）、加工条件（包括时间、温度、压力、湿度、水分活性和pH值）、施用方法以及包装和储存条件，都会影响益生菌的存活率，从而进一步影响其疗效。益生菌在宠物食品中的功效是一个新的研究领域，需要以新的应用策略、有效的菌株选择和验证潜在健康益处的形式进行发明，以确保产品的有效性。因此，本研究评估了Lm宠物治疗对猫CKD的疗效，并阐明了宿主-微生物相互作用的潜在机制。本研究阐明了CKD猫中Lm的可能机制，并提供了一种用益生菌治疗猫的可能新方法。

2、材料与方法（节选）

3、结果

3.1 Lm宠物零食的安全性及稳定性

对Lm宠物零食的化学和微生物分析显示没有病原菌或有害残留物的证据，因此这些零食符合所有相关监管标准（表S5）。在室温下储存时，Lm宠物零食的水分、酸值和过氧化值（POV）在储存8周后没有明显变化（表S6）。贮藏12周后，三种口味的Lm宠物零食的平均乳酸菌数量从4.3×108 CFU/g逐渐下降到5.4×106 CFU/g（图2）。CKD猫（3-5kg）的Lm有效剂量为2.79-3.93×108CFU/cat/d。因此，每只体重小于5公斤的猫每天应给予10克Lm宠物零食，以获得有效的益生菌剂量。对于体重超过5公斤的猫，Lm宠物零食的数量是单独计算的，以确保它们符合所需的益生菌摄入量。在我们的研究中，一只猫重6.3公斤，因此每天需要摄入12 克Lm宠物零食。Lm宠物零食每月生产一次，并直接发送给主人，以保持Lm的可行剂量。

图2、乳酸酸菌在 Lm 宠物零食中的储存稳定性（每5公斤食物含 50 克益生菌粉）。数据以平均值±标准差（n = 3）表示。CA：鸡肉+鱼; CB：鱼+羊肉; CC：鸡肉。* P < 0.05提示与0周相比的显著差异。

3.2 Lm宠物零食在CKD猫生活质量和肾脏功能的影响

在给予 Lm 治疗期间保持血液和尿液生化参数，但血清磷酸盐除外，血清磷酸盐在服用Lm治疗后显着升高（p < 0.05）。被测试猫的体重也保持稳定（表S7），表明Lm对患有CKD的猫没有不良影响（表S8）。肌酐是肾功能的关键指标，在Lm治疗8周后，每次测量都向较低的分布（90%的CIs）移动，p值= 0.06（表2），所有猫的肌酐都降低，表明Lm治疗对CKD进展的潜在缓解作用（图3A）。50%的猫的尿素氮水平也降低或维持。肾功能指标显示PF-1有所改善，PF-1从CKD的第三阶段进展到第二阶段（表S9）。其他受试者保持各自的CKD阶段。

使用Lm治疗2个月后，100%（6/6只猫）提高/维持其活动度的猫中，66.67%（4/6只猫）的CKD猫都有食欲的提升，。一只猫有更好的排便频率，而其他的猫（83.33%）保持不变（图3B）。猫主人的反馈也显示，在使用Lm治疗后，猫大便的形状和颜色有所改善。

图3、Lm 宠物零食对 CKD 猫的影响。（A）血浆值和肾功能指标的倍数变化。（B）慢性肾病猫的生活质量。数据以 SEM 的平均值± （n = 6） 表示。PF：宠物食品组

3.3 使用Lm治疗后，GDUTs在血浆中的影响

虽然两组间血浆TMAO、IS、PCS、PS差异无统计学意义(p 0.05)，但仍进一步以CIs(90%)评价GDUTs，以评价治疗效果。本研究中的CIs表明，在Lm治疗4周后，IS具有潜在的临床意义(表2)。在Lm治疗8周后，比较猫个体的百分比变化，66%，50%和50%的CKD猫，分别降低或维持其血浆TMAO、IS和PCS水平（图4）。

图4.给予 8 周 Lm 宠物零食后的血浆值和尿毒症毒素的倍数变化。（A）三甲胺-N-氧化物（TMAO），（B）吲哚硫酸盐（IS），（C）硫酸苯酯（PS）和（D）对甲酚硫酸盐（PCS）。数据以 SEM 的平均值± （n = 6） 表示。使用 Wilcoxon 符号秩检验进行统计分析。PF：宠物食品组。

3.4 Lm宠物零食改良了CKD猫的粪便菌群

我们使用16S全长测序来探查Lm治疗与肠道菌群组成的联系，表明Lm 治疗后Shannon指数和α多样性指数显着增加（p < 0.05），而Pielou均匀度增加（p = 0.06）（图 5A）。相反，PCoA图中的β多样性仅显示出轻微的变化，分别为PC1和PC2中肠道微生物群总组成的24.4%和21.7%（图5B）。这些发现表明，Lm增加了系统发育相似的微生物物种的丰富度，增强了这些物种之间的均匀性，同时维持了猫科动物的核心肠道微生物组组成。

图5、CKD猫的菌群分析。（A）不同CKD猫粪便微生物群试验前后的差异。结果显示为具有最小值和最大值的四分位数 （n = 6）。使用 Wilcoxon 符号秩检验进行统计分析。* p < 0.05 表示与第 0 周相比有显著差异。（B） 阿尔法多样性。（C） Beta多样性。（四）物种水平的分类变化。每个点代表一只猫。字母 C 和 Ctrl 代表施用 Lm 之前的粪便样本;字母 L 和 Lm 代表施用 Lm 后的粪便样本。

乳杆菌混合物（Lm）处理前后的肠道微生物构成分析，主要包含4个优势菌门，厚壁菌门（Firmicutes；~90%）、放线菌门（Actinobacteria；~10%）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）（图5C），以及10个主要菌科，其中消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）在菌群中占主导地位（从55.0%到43.5%），其次是毛螺旋菌科（Lachnospiraceae；从30.0%到35.0%）、红蝽菌科（Coriobacteriaceae；从5.8%到6.62%）、梭菌科（Clostridiaceae；从2.4%到4.6%）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae；从2.6%到3.0%）、颤螺旋菌科（Oscillospiraceae；从1.7%到3.7%）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae；从0.7%到1.2%）、真杆菌科（Eubacteriaceae；从0.7%到0.3%）、消化球菌科（Pepcococcaceae；从0.6%到0.2%）和肠球菌科（Enterococaceae；从0.0%到0.5%）。属水平上，Peptacetobacter是占比最高的菌属（从55.0%到42.7%），其次是经黏液真杆菌属（Blautia；从28.2%到32.3%）、柯林斯氏菌属（Collinsella；从5.7%到6.6%）、梭菌属（Clostridium；从2.4%到4.6%）、双歧杆菌属（Bifidobacterium；从2.6%到3.0%)、Subdoligranulum属（从0.9%到2.1%）、Drancourtella属（从0.5%到1.1%）、Mediterranebacter属（从0.7%到0.9%）、Solobacterium属（从0.5%到0.8%）和Faecalimonas（剩余0.5%）（图5C）。

在猫肠道菌群中共鉴定出121个菌种，排名前10位的分别为：Peptacetobacter hiranonis（从55.0% 到42.7%）、Blautia caecimuris（从10.1% 到14.9%）、Blautia schinkii（从4.3% 到 3.3%)、Blautia coccoides（从3.1% 到 1.6%）、Blautia argi（从3.0% 到 1.3%）、Blautia glucerasea（从2.5% 到 4.2%）、Collinsella aerofaciens（从1.5% 到 1.3%）、Collinsella tanakaei（从1.1% 到 1.7%）、Blautia faecicola（从1.0% 到 2.3%）、Subdoligranulum variabile（从0.9% 到 2.1%）(图5C)。

在物种水平上，个体粪便微生物组也存在差异（图5D），例如，PF-1猫的Blautia比例很高，而其他5只猫的P. hiranonis更多。然而，在用Lm宠物治疗后，他们显示出粪便微生物群的类似变化（图6A）。消化链球菌科显著减少（p < 0.05），而乳杆菌科和双歧杆菌从第0周增加到第8周。在物种水平上，Blautia hominis （p < 0.05）、B. coccoides （p = 0.063） 和 P. hiranonis （p = 0.063） 减少，但试验后 Blautia 属增加。此外，在临床试验后，在两只猫咪中检出其中一种 Lm 细菌菌株（植物乳杆菌）。

图6、（A)粪便微生物群中特定细菌的相对丰度。结果以最小和最大的四分位数表示(n = 6)。Ctrl组和Lm组分别代表给予益生菌宠物治疗前后的样品。(B) CKD猫粪便中每克细菌的数量。结果以平均扫描电镜(n = 6)表示。每个点代表一只猫。相对丰度分析采用Wilcoxon符号秩检验，qPCR分析采用比值配对t检验。0.05

通过qPCR定量粪便微生物群中与CKD相关的细菌（图6B），显示乳酸菌和肠杆菌科分别在Lm宠物零食给药8周后显着上调（p < 0.05）和下调（p = 0.071）。

3.3 Lm宠物治疗改变肠道微生物功能

进行遗传功能预测（图 7）显示，与产生尿毒症毒素相关的途径，包括“酪氨酸代谢 （ko00350）”、“苯丙氨酸代谢 （ko00360）”、“色氨酸代谢 （ko00380）”和“苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成 （ko00400）”，在 Lm 处理后没有差异，而碳水化合物相关途径“半乳糖代谢 （ko00052）”显着更高（p < 0.05）。临床试验后，脂质代谢途径“甘油脂代谢（ko00561）”、“甘油磷脂代谢（ko00564）”、“亚油酸代谢（ko00591）”和“α-亚麻酸代谢（ko00592）”上调（p < 0.1）。

图7、比较试验前后粪便微生物群PICRUSt功能预测的相对丰度。结果以平均值± SEM （n = 6） 表示。Ctrl 组和 Lm 组分别代表服用益生菌宠物零食之前和之后的样品。在 KEGG 通路 3 级中选择了不同的基因类别。使用Wilcoxon匹配对符号秩检验进行统计分析。* p < 0.05。

首先在8种细菌和5种CKD危险因素之间构建了Spearman相关网络，这些细菌在给药Lm治疗之前和之后有显着差异（图8A）。所有属于Blautia亚属的细菌都与尿素和肌酐呈负相关，尤其是Blautia亚属（p < 0.05）。在尿毒症毒素分析中，盲肠芽孢杆菌和蓝肠杆菌与IS和TMAO呈显著负相关（p < 0.05），而Peptostreptococcaceae和P. hiranonis与肾功能指标和尿毒症毒素（尤其是肌酐和TMAO）呈显著正相关（p < 0.05）。细菌种类与KEGG通路之间的相关网络，分别揭示了与KEGG 3级通路的2个和3个正负相关关系（p < 0.05，图8B）。双歧杆菌和梭状芽孢杆菌分别与苯丙氨酸代谢和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径呈负相关（图8B）。

图8、.生物标志物的 Spearman 相关性分析和 （A） CKD 进展的危险因素和（B） KEGG通路。* p < 0.05。BUN：血尿素氮；CREA：肌酐；IS：吲哚硫酸盐；PS：硫酸苯酯；TMAO：三甲胺-N-氧化物。

4.讨论

在目前的研究，一个新的低温油扩散法被发展起来，用以在宠物食品表面添加乳酸杆菌混合物（Lm，植物乳杆菌亚属，植物乳杆菌MFM30-3及副干酪乳杆菌亚属，副干酪乳菌MFM 18）。这些Lm宠物商品的化学性质和细菌稳定，室温下保质期为4个月。旨在确保食品的安全和延长保质期时宠物食品生产会对益生菌的存活产生负面影响。进一步验证潜在的健康益处对于确保宠物食品中益生菌的功效至关重要。尽管使用Lm益生菌治疗前后血浆指标和GDUT没有显着差异（由于样本量有限），但我们仍然在这项非盲、单臂试验中发现了Lm益生菌治疗潜在的CKD缓解作用对2-3期CKD猫的研究。两个月后观察到 CKD 猫有害GDUT (IS)和CKD血浆指标（肌酐和 BUN）下调（置信区间 = 90%）和生活质量（食欲、活动和排便频率）改善的临床趋势。Lm宠物治疗干预。这与我们之前使用腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型和CKD患者临床试验进行的研究一致。这一发现证明 Lm 益生菌有潜力与各种基质一起应用，而不会对它们的健康益处产生负面影响。统计显着性表明研究结果的可靠性，这取决于研究的样本量，而临床显着性反映其对临床实践的影响，强调估计的效应大小及其精度（例如置信区间）。为了评估Lm宠物零食对CKD猫的实际治疗效果，本研究通过90%置信区间和p < 0.1解释临床意义。

大量研究显示，益生菌对人类CKD患者的生理功能有很大影响，包括减少尿毒症毒素和相关前体、调节肠道菌群、调节免疫能力、保护胃肠道和改善胃肠道症状，但很少有研究评估益生菌和益生菌宠物食品对猫CKD的影响。血清肌酐是主要的评估指标之一，因为它是计算估计肾小球滤过率（eGFR）以衡量肾功能稳定性的主要参数。在给予Lm宠物零食后，所有受测猫的血浆肌酐水平维持或降低表明对猫科动物CKD有潜在的缓和作用。先前一项针对CKD 2-4期猫的临床研究表明，大多数猫的尿素和肌酐水平在服用合生元两个月后下降，但在与猫粮混合或撒在猫粮上的益生元的CKD对应物中未观察到这种影响。

在Lm治疗两个月后，还观察到CKD猫的生活质量改善，包括食欲、活动和排便频率。猫和CKD患者便秘的风险增加，这将进一步影响他们的生活质量。便秘可能导致结肠中未代谢的氨基酸和肽的发酵增强，导致更多尿毒症毒素前体的产生和吸收。故而排便频率越高，粪便越湿又软，会促进身体排泄物的排出，而不是堆积。因此，Lm宠物零食可能是一种补充益生菌的新方法，并在 CKD 猫的生活质量和肾功能方面提供潜在益处。

CKD病患的肠道菌群失调会导致CKD进展恶化。猫科动物粪便细菌的多样性和丰度通过Lm宠物零食干预得以恢复。大多数在Lm处理后显示出较低丰度的细菌分类群，属于蛋白水解科（Peptostreptococcaceae和Enterobacteriaceae）。消化链球菌科（Peptostreptococcaceae）和肠杆菌科（Enterobacteriaceae）具有GDUT前体酶，有助于人类吲哚、苯酚和TMAO的产生，在CKD患者中比在健康受试者中更丰富。相关性分析与猫科动物肠道微生物组的发现一致。消化链球菌科与肾功能指标和尿毒症毒素呈正相关。猫粪便中的有益细菌乳酸菌在服用Lm宠物零食后升高。乳酸杆菌科（尤其是乳酸菌）是产生丁酸的细菌，对肠道稳态很重要。此外，在食用益生菌宠物零食8周后，在2只测试猫的粪便中检测到植物乳杆菌（图6A），表明Lm可以保存在肠道中。Lm菌株的丰度可能会影响其改善肠道代谢物和肾功能的功效。然而，还需要进一步研究以确定影响益生菌定植的因素。

有趣的是，在给 CKD 猫喂食Lm宠物零食后，Blautia 菌种在丰度方面表现出不同的变化，但它们都与肾功能指标和GDUT呈负相关。据报道，CKD患者和慢性肾衰竭 (CRF) 大鼠的肠道菌群中存在丰度较低的 Blautia 属，并且它也与血浆尿毒症毒素呈负相关。然而，Blautia在CKD 第5期患者中很丰富，这表明不同的Blautia菌株可能会产生不同的影响。饮食对肠道菌群的影响也值得注意，猫粪便菌群中Blautia和Peptostreptococcaceae的丰度较高分别与食用粗磨食物和罐头食品有关。这或许可以解释为什么PF-1猫和其他猫的肠道微生物组成存在差异。肠道微生物组成的改变与 KEGG 微生物功能的显著变化有关，其中苯丙氨酸途径与Lm宠物零食的CKD缓解作用最为相关。在糖尿病肾病患者中检测到了异常的苯丙氨酸代谢。然而，很少有研究揭示益生菌对 CKD 患者和猫的下游微生物功能的影响。对猫肠道菌群、KEGG 微生物功能和肾功能指标的分析阐明了Lm宠物零食的CKD缓解作用的可能下游机制，涉及下游功能性苯丙氨酸途径。

5、结论

LM 宠物零食可能为缓解CKD的进展提供潜在的支持选择，并有可能改善患有CKD的猫的生活质量。给药Lm pet治疗调节的猫微生物群（消化链球菌科、乳酸菌、蓝藻和肠杆菌科），进一步调节参与苯丙氨酸代谢的微生物功能，有助于下调有害的IS。Lm菌株的丰度可能会影响它们在改善肠道来源代谢物和肾功能方面的功效。尽管需要大规模的临床研究来验证这一发现，但目前的研究为益生菌宠物食品或慢性肾病宠物的零食提供了潜在的辅助治疗见解。据我们所知，这项研究是第一个直接评估CKD减轻宠物零食功效的研究。