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什么是非发酵菌属？
非发酵菌属（Non-fermenting bacteria）是一类需氧或兼性厌氧、无芽胞、不发酵葡萄糖，或仅以氧化形式利用葡萄糖的革兰阴性杆菌或球杆菌。它们广泛存在于人和动物体表、开放体腔以及医院相关的外环境中，多为条件致病菌。常见的非发酵类细菌有假单胞菌属（Pseudomonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、莫拉菌属（Moraxella）、无色杆菌属（Achromobacter）和鞘胺醇单胞菌属（Sphingomonas）等。除不动杆菌属和嗜麦芽窄食单胞菌等少数菌种外，其他菌种氧化酶均为阳性。近年来，由非发酵菌引起的临床感染日益增多，部分菌株呈现多重耐药和泛耐药，引起临床医学及检验医学的重视。
图1. 假单胞菌引起的临床疾病(图源microbiologynotes.org)
本实验室统计了近半年共1446个病例，发现非发酵类细菌的感染以假单胞菌属和不动杆菌属为主。其中铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染标本占比13.7%，在这些病例中呼吸道标本有59例，占总阳性标本的5.7%；耳道标本有41例，占总阳性标本的4.0%；尿液标本仅有12例，占总阳性标本的1.2%；其它分泌物标本共占29例，占比2.8%。呼吸道标本有344例样本中铜绿假单胞菌占比17.1%，耳道标本有182例中铜绿占比22.5%。此外我们还统计了铜绿的药敏数据，其中铜绿多重耐药占比23%，头孢噻呋的耐药率占比76.8%，头孢西丁的耐药率占比为15.3%，头孢吡肟的耐药率占比有15.1%，马波沙星的耐药率为30.7%，恩诺沙星的耐药率为：15.2%。
不动杆菌属共占比5.8%，其中呼吸道有33例，占总阳性标本的3.2%，耳道有18例，占总阳性标本的1.8%。耳道标本共182例，不动杆菌属占比9.8%。呼吸道标本共344列，不动杆菌属占比9.6%。不动杆菌属的多重耐药率占比为：20.4%，多西环素的耐药比率为：33.3%，头孢噻呋的耐药占比为17.6%，头孢西丁耐药率为16.5%、恩诺沙星的耐药率为16.8%，马波沙星的耐药率为17.2%
铜绿假单胞
图2. 铜绿假单胞菌构象（图源media.springernature）
假单胞菌属分布广泛，在土壤、水和空气中均有存在，多为条件致病菌。在非发酵菌感染中，假单胞菌属细菌所占比例高达 70%~80%，其中又以铜绿假单胞菌感染最为常见。但需要注意荧光假单胞菌的血流感染，特别是近期输注过血液制品后出现的血流感染，因该菌能在 4℃生长，与血液制品的污染关系密切。
菌落形态
铜绿假单胞菌在血琼脂平板上35 ℃环境下培养18~24h，可形成灰绿色、大而扁平、湿润、有金属光泽和透明溶血环的菌落，一些铜绿假单胞菌有生姜气味。
在麦康凯培养基上大体上可形成5 种不同的菌落：
(1) 伞状菌落：形态不规则，边缘呈伞状伸展。
(2) 大肠菌样型菌落：圆形、凸起、无色透明，似大肠埃希菌的菌落。
(3) 粗糙型菌落：早纽扣状，表面粗糙，或菌落中央隆起、边缘扁平。
(4) 黏液型：菌落光滑、隆起、呈黏液状，嵌人培养基中不易挑起，似肺炎克雷伯菌菌落，但为无色半透明。
(5) 侏儒型：生长缓慢，通常培养18 h尚不可见，24h后才有细小菌落。
图3. 铜绿假单胞菌形态（图源维基百科）
细菌毒力
铜绿假单胞菌含有多种毒力因子，包括黏附素、内毒素、外毒素、多糖荚膜样物质、绿脓菌素(pyocyanin)及侵袭性酶类等，在细菌的侵入、扩散和感染中发挥重要作用。
临床上，铜绿假单胞菌可引起伤口和创面感染、呼吸道感染、泌尿道感染及败血症等。重度感染可发生在局部组织损伤或抵抗力下降动物中，如应用广谱抗生素、激素、抗肿瘤药物及免疫抑制剂等药物的动物，以及患有囊性纤维化、免疫缺陷和老年动物等。对于伤口感染者，应特别注意防范脓毒症的发生，以降低感染后的死亡率。
耐药机制
(1) 膜结构：铜绿假单胞菌拥有一个复杂的外膜结构，这个外膜含有脂多糖和蛋白质通道，对多种抗生素具有较低的渗透性，此外铜绿假单胞菌擅长形成生物被膜，这是一种由细菌和胞外聚合物构成的三维结构。生物被膜中的细菌比游离状态下的细菌对抗生素更加耐药，这意味着即使抗生素能够到达细菌周围，它们也很难穿透铜绿的外膜进入细胞内发挥作用。
(2) 药物灭活酶：铜绿假单胞菌能够产生多种药物灭活酶，例如β-内酰胺酶，这些酶可以破坏抗生素的化学结构，使其失效。
(3) 遗传多样性和水平基因转移：铜绿假单胞菌具有高度的遗传多样性，可以通过质粒、转座子等移动遗传元素获取和传递耐药基因促进了多重耐药性的发展和传播。
(4) 主动外排泵：铜绿假单胞菌拥有高效的主动外排泵系统，可以将进入细胞内的抗生素迅速泵出体外，减少抗生素在细胞内的浓度，从而避免其发挥抗菌作用。
感染铜绿假单胞的宠物经药敏治疗3-4天后，原来敏感的抗菌药物易转为耐药，因此对于铜绿假单胞菌感染，尤其是重症感染者需多次进行药敏实验。
药敏实验
实验的判断标准参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)抗微生物药物敏感性试验标准制定。应关注细菌的天然耐药谱，用药时应选择避免。不同细菌的药敏结果不尽相同，药敏报告无法显示所有临床常见药物，可通过其耐药机制和标志性药物预测其它抗菌药物的敏感性。
A组：一般认为常用且有效的药物，所列的药物用作常规试验，并常规报告结果。
B组：与A组的效果基本等同，可用于常规试验，但只做选择报告，一般作为A组药物耐药时使用。
C组：替代性、补充药物，一般在治疗过敏患者、治疗对数种药物耐药特别是对某一类抗生素均耐药的细菌感染时使用。
O组：有临床适应症但通常不作为常规测试与报告药物
药物分组 药物名称
A组 | 头孢他啶、哌拉西林舒巴坦、庆大霉素、妥布霉素 |
B组 | 头孢他啶阿维巴坦、头孢吡肟、头孢地尔 亚胺培南、多立培南、美罗培南、左氧氟沙星、环丙沙星 |
O组 | 哌拉西林、多粘素B、氧氟沙星、诺氟沙星、诺美沙星 |
注：使用多黏素B治疗时应按照肾功能用最大剂量给药。
建议治疗方案
对于非多重耐药铜绿假单胞菌感染或病情较轻的患者可采取具有抗假单胞菌活性抗菌药物的单药治疗。对多重耐药铜绿假单胞菌感染或重症患者常以敏感的β-内酰胺类抗生素为基础的联合治疗,并尽可能避免患者近期使用过的抗菌药物。
铜绿假单胞菌治疗的国内外指南常推荐的联合用药方案包括：
抗假单胞菌β内酰胺类+氨基糖类，
抗假单胞菌β内酰胺类+抗假单胞菌喹诺酮类，
抗假单胞菌喹诺酮类+氨基糖苷类、
以及采用双β内酰胺类联合治疗。
联合应用大环脂类（如阿奇霉素）和喹诺酮类（如氟罗沙星）治疗。
虽然大环脂类本身无抑制铜绿假单胞菌的作用，但可抑制该菌生物被膜的形成，增加喹诺酮类药物对生物被膜的渗透性，提高其抗铜绿假单胞菌的作用。
而对碳青霉烯类耐药尤其是广泛耐药或全耐药铜绿假单胞菌的肺部感染，国外推荐上述联合的基础上再加多黏菌素的治疗。针对铜绿假胞菌肺炎初始治疗的抗菌药物：轻度感染，使用哌拉西林 (或环丙沙星) +妥布霉素 ；中-重度感染，采用上述三代头抱菌素+阿米卡星；极严重或伴有免疫功能受损的患者采用亚胺培南(或氨曲南)+阿米卡星。
此外经纤支镜反复做支气管肺泡灌洗，或经雾化器吸入方式局部给予阿米卡星或头孢他啶，可作为铜绿假单胞菌肺炎的一种辅助疗法。
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不动杆菌属
不动杆菌属广泛存在于自然界和医院环境，并能够在人体皮肤表面、潮湿的环境中、甚至干燥的物体表面上生存，包括皮特不动杆菌、醋酸不动杆菌、鲍曼不动杆菌、皮氏不动杆菌等。该菌可分离于血液、尿液、脓液、呼吸道分泌物及脑脊液等标本中，其临床分离率仅次于假单胞菌属。近年来，鲍曼不动杆菌感染呈上升趋势，并不断出现多重耐药和泛耐药菌株。
菌落形态
不动杆菌常成双排列，菌体大小2.0umx1.2m无鞭毛、无动力、无芽胞。专性需氧菌，对营养要求一般,在普通琼脂平板上生长良好，最适生长温度为 35℃，部分菌株可在42℃生长。能在麦康凯琼脂平板上生长，但在 SS 琼脂平板上只有部分菌株生长。在血琼脂平板上 35℃培养 18~24 小时大多数可形成灰白色、圆形、光滑、边缘整齐、直径2~3mm 的菌落。
图5. 麦康基和血琼脂上的不动杆菌(图源medical-labs)
致病性
机会致病菌，几乎在任何介质表面都能定殖，且对环境因素、消毒药和抗菌药普遍具有很强的抵抗力，这是造成医院感染的重要原因。动物病例较少，可引致新生驹败血症、牛乳腺炎、水牛流产等，具有多重耐药性和极端耐药性有的菌株对目前所有抗菌药物均有抗性，抗药性有固有机制和特异机制。目前，其发病率和致死率接近耐药性葡萄球菌，故有“革兰阴性的耐药萄球菌”之称。
细菌毒力
毒力因子包括荚膜多糖、菌毛、STX毒素(和肠道菌相同)、溶血素、多种白细胞毒素、酶、肤酶和磷脂酶等。具有表面黏性多糖，使细菌表面有强疏水性，逃避吞噬且黏附宿主细胞。脉酶也参与黏附。OmpA致宿主细胞凋亡或坏死，可形成菌毛介导的生物被膜 (pilus mediated biofilm，PMB)。
药敏实验
实验的判断标准参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)抗微生物药物敏感性试验标准制定。应关注细菌的天然耐药谱，用药时应选择避免。不同细菌的药敏结果不尽相同，药敏报告无法显示所有临床常见药物，可通过其耐药机制和标志性药物预测其它抗菌药物的敏感性。
A组：一般认为常用且有效的药物，所列的药物用作常规试验，并常规报告结果。
B组：与A组的效果基本等同，可用于常规试验，但只做选择报告，一般作为A组药物耐药时使用。
C组：替代性、补充药物，一般在治疗过敏患者、治疗对数种药物耐药特别是对某一类抗生素均耐药的细菌感染时使用。
O组：有临床适应症但通常不作为常规测试与报告药物
U组：泌尿道使用药物
药物分组 药物名称
A组 | 头孢他啶、氨苄西林舒巴坦、美罗培南、亚胺培南、多立培南、庆大霉素、环丙沙星、妥布沙星 |
B组 | 头孢噻肟、头孢曲松、头孢地尔、多西环素、米诺环素、复方新诺明 |
O组 | 哌拉西林、替卡西林克拉维酸、多粘素B |
U组 | 四环素 |
注：使用多黏素B治疗时应评估肾功能用最大剂量给药。
由于培养基中可能存在拮抗剂，甲氧节院和磺胺类药物抑菌圈内可允许出现菌株轻微生长。
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其它常见的致病性非发酵菌
博代氏菌属（Bordetella）
博代氏杆菌也译作波氏杆菌，属产碱杆菌科，对人或动物有致病性，均引起上呼吸道感染。百日咳波氏菌（Bordetella Pertussis）和霍氏波氏菌（Bordetella horseni），亲缘关系最近，只感染人，并是其唯一宿主；副百日咳波氏菌（Bordetella parapertussis）包括绵羊适应株和人适应株，互不交叉感染，也可引起人类百日咳样症状，但通常较轻；而支气管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）可感染多种动物和免疫抑制的病人。
图6. 支气管败血博代氏菌菌落形态(图源vetbact.org)
支气管败血博代氏菌
（Bordetella bronchiseptica，B.br）
本菌曾称为犬支气管杆菌，因最初从患呼吸道病的犬体内发现，此后发现有多种宿主，因此改为现名。主要生物学特征是在牛血平板上35℃培养48h，菌落直径0.5~1mm，呈圆形、光滑、边缘整齐。某些菌株发生β-溶血，并可同时出现大小不等的溶血菌落及不溶血变异菌落。麦康凯培养菌落蓝灰色，周围有狭窄红色环，培养基着染珀色。具有O、K 和H 抗原。抗原耐热，为属特异性抗原。K抗原由英膜抗原和菌毛抗原组成，不耐热另有少量细胞有结合性耐热 K抗原。抵抗力不强，常用消毒剂均对其有效。在液体中，58℃经15 min 可将其杀灭。
图7. 患B.br脑膜脑脊髓炎犬的脑脊液
(图源frontiersin.org，胞内细菌-箭头)。
本菌经气溶胶传播，遍布全世界，感染多种哺乳动物，包括猪、犬、猫、马、牛、绵羊和山羊等家畜，免、豚鼠、小鼠、大鼠、仓鼠及猴等实验动物，鼠、雪貂、刺猾、浣熊、狐、臭购、独、考拉及海洋哺乳动物等野生动物。会引起急、慢性呼吸道炎症，统称为博代氏菌病 (Bordetellosis)，最有代表性的是犬传染性气管支气管炎(犬窝咳)、兔支气管炎/肺炎以及猪委缩性鼻炎。犬感染后的临床症状为持续性咳嗽（通常描述为"鹅叫样"），有时伴有呕吐；猫则是持续性咳嗽、喷嚏、鼻眼分泌物增多。诊断方式包括PCR、细菌培养以及血清学检测等。
治疗该菌的首选抗生素为多西环素，但具体用药方案应基于药敏试验结果和个体情况，某些情况下可能需要静脉给药。期间应保持环境湿度适宜，可使用湿热蒸汽雾化进行支持治疗，必要时给予支气管扩张剂。通常治疗周期为7-14天，重症者可能延长。可通过接种博代氏杆菌疫苗预防该病，特别是对于经常与其他动物接触的宠物。如出现继发性细菌感染或其他并发症，可能需要额外的治疗。某些动物可能成为无症状携带者，这在治疗和预防策略中需要考虑。
军团菌属（Legionella）
军团菌属于1976年7月美国军人在费城集会时爆发的一场肺炎中发现，并由此命名。这类细菌广泛存在于天然水环境(湖、河、喷泉)中，以及冷、热水管道系统内，在31~36℃水中可长期存活。军团菌属包含多个种类，其中最具病原性的菌种是嗜肺军团菌（Legionella pneumophila），它是引发人类军团病（Legionnaires' disease）和庞蒂亚克热（Pontiac fever）的主要病原体，也可感染其他免疫力低下的哺乳动物和鸟类。
图8. 嗜肺军团菌菌落形态（图源sites.gsu.edu）
军团菌为兼性胞内寄生菌，在自然界中多寄生于阿米巴原虫体细胞内，感染时在单核细胞和巨噬细胞内增殖，它们在20℃至50℃之间的水中繁殖最为活跃，尤其是在25℃至42℃之间的温水中生长最好。胞内繁殖的场所是内质网囊泡，由繁殖型转变为胞内成熟型。气溶胶、原虫是重要的传播载体，人与人之间通常不直接传播。毒力因子有淋巴细胞毒素、溶血素、磷脂酶、氨基肽酶、内切酶、β内酰胺酶、LPS、铁载体及金属蛋白酶等。具有I~V型分泌系统，同时多贝拥有V型中的A型(T4ASS)和B型(TBSS)TBSS和I型接合元件高度同源，是核心毒力机制，参与内质网复制泡的形成以及诱导细胞凋亡、释放子代细菌。
图9. UV照明下的军团菌属（图源wikidoc.org）
军团菌对许多常见的消毒剂具有一定的耐受性，因此在一些水系统中不易被彻底清除。其共生的原生动物宿主也可以在消毒过程中为军团菌提供保护。可通过培养法、血清学方法、分子生物学方法等进行诊断。通常使用大环内酯类、氟喹诺酮类等抗生素治疗，具体用药方案应基于药敏试验结果。军团菌引发的疾病主要发生在群体性爆发中，尤其在大型建筑物、医院、酒店等集中供水系统中。一旦军团病爆发，往往涉及较大的范围，因此需要及时的防控和管理措施。有效的水处理和预防措施可以显著降低军团病的爆发风险。
元医动物医学诊断实验室
微生物平台项目优势
动物病原微生物二级实验室（ABSL-2）备案
采用全自动MIC药敏分析仪，MIC+KB双方法学开展药敏试验
严格遵循CLSI-2023+CLSI-VET01/08/09国际临床微生物试验标准执行
MALDI-TOF微生物质谱法+16S rRNA基因扩增测序法进行微生物鉴定
比色与比浊联合测定，4波长同时检测，定时不间断自动判读，AI智能算法模型。
多中心联合构建的菌株库、数据库和专家系统，数据库实时更新，结果报告更有保障。
自动修正天然耐药和强制耐药的药敏解释，涵盖ESBLs、CRE、MRSA、VRE、PRSP高水平耐药和诱导耐药等临床耐药表型检测。
需氧/厌氧/兼性厌氧菌、酵母菌、皮肤癣菌、血培养多种培养方式
药敏试验涵盖兽用及人用常见抗生素50+，前沿新药10+
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参考文献
[1] Panickar A, Manoharan A, Anbarasu A, Ramaiah S. Respiratory tract infections: an update on the complexity of bacterial diversity, therapeutic interventions and breakthroughs. Arch Microbiol. 2024 Aug 17;206(9):382.
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[5] 周庭银,章强强.临床微生物学诊断与图解(第四版).上海科学技术出版社,2017.
[6] 陆承平. (2001).兽医微生物学.中国农业出版社.
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